北京大學人民醫院胃腸外科團隊發現CTSD N-糖基化修飾影響結直腸癌肝轉移

研究背景：

結直腸癌是全球五大致命癌癥之一，在中國是第二大常見惡性腫瘤。肝轉移是患者預后不良的主要原因，25%的患者初診時已有肝轉移，術后15%-25%因肝轉移復發，90%的肝轉移患者無法獲得有效治療，IV期患者5年生存率僅24%。N-糖基化修飾在蛋白質的多種功能中起關鍵作用，且與惡性腫瘤轉移相關，但目前關于結直腸癌肝轉移相關的N-糖基化蛋白質組學研究較少。

研究方法：

收集14例結直腸癌肝轉移患者的原發性病灶和配對肝轉移病灶樣本，經處理后進行液相色譜-質譜（LC-MS）分析。對多種細胞系進行培養，構建CTSD突變體，通過轉染、感染等操作，進行細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等實驗。構建裸鼠皮下腫瘤和肝轉移模型，觀察腫瘤生長和轉移情況。

主要研究結果：

1.CRC患者肝轉移性病變表現出比原發性病變更高的CTSD N-糖基化水平

通過質譜技術，研究人員對比了14例原發性病灶和14例配對肝轉移病灶的N-糖基化修飾差異，共檢測到139種N-糖基化蛋白、185個N -糖基化修飾位點、490個完整結構的N-糖肽以及71種糖基。其中46個N-糖基化修飾位點此前未被Uniprot平臺報道。在肝轉移病灶中，有13個位點的N-糖基化修飾水平變化超過1.5倍。N-糖基化位點周圍的氨基酸序列具有一定保守性。44.94%的N-糖基化位點被單一、固定的糖基修飾，20.86%的N-糖蛋白含有多個N-糖基化修飾位點。借助GO和KEGG分析發現，這些N-糖基化蛋白可能屬于分泌蛋白和膜蛋白。在生物學過程方面，主要參與細胞間粘附、蛋白水解和免疫反應等；分子功能則主要與結合活性相關。KEGG通路富集分析表明，它們可能涉及溶酶體、細胞外基質-受體相互作用以及藥物-受體等相關途徑。此外，在 Cathepsin D（CTSD）的第263位殘基處，發現 2488.06545（PrecursorMH）作為H (6) N (2) 糖基的結構修飾，在肝轉移病灶相對于原發性病灶的修飾變化倍數絕對值最高。同時，H (5) N (2)和H (7) N (2)的 N-糖基化修飾水平在肝轉移病灶中也顯著增加，這表明肝轉移病灶中CTSD第263位殘基的N-糖基化修飾水平整體高于原發性病灶。

圖1結直腸癌原發性病灶和配對肝轉移病灶中N - 糖基化蛋白的相關分析

2. CTSD糖基化修飾特征及相關位點突變對蛋白的影響

對5例CRC患者的原發性病灶和配對肝轉移病灶進行檢測，發現肝轉移病灶中CTSD的N -糖基化水平高于原發性病灶。同時，在多種CRC細胞系中評估CTSD的糖基化水平，CTSD在不同CRC細胞系中的糖基化水平存在差異。使用PNGase F和衣霉素處理細胞系后，CTSD 的分子量下降，表明CTSD存在N-糖基化修飾，且經處理后從糖基化形式轉變為非糖基化形式。分析發現CTSD在天冬酰胺殘基 263（N263）處具有進化保守性。UniProt 蛋白數據庫預測CTSD有2個潛在N-糖基化位點（天冬氨酸殘基134和263）。隨后在SW480和 SW620 細胞系中沉默內源性CTSD 表達，再分別轉導編碼野生型 CTSD（CTSD WT）或突變型CTSD（CTSD N263Q、CTSD N134Q/N263Q）的外源質粒，成功構建穩定表達細胞模型。通過對比突變前后及經 PNGase F 處理的CTSD分子量變化，確定CTSD僅在殘基 134和263處存在N-糖基化修飾位點。

  圖2 CTSD N-糖基化修飾位點驗證

3.CTSD N263位點糖基化修飾促進CRC生長和轉移

將CTSD野生型（WT）和N263Q突變型（非糖基化）的SW480細胞分別皮下注射至裸鼠，成瘤實驗的結果表明CTSD WT組腫瘤體積顯著大于N263Q組，且腫瘤外觀更明顯、重量更重。在肝轉移裸鼠模型中，WT組裸鼠肝臟表面可見明顯轉移結節，而N263Q組肝臟無肉眼可見轉移灶；HE染色顯示WT組肝臟存在典型轉移灶，N263Q組肝臟組織正常，無轉移跡象，表明CTSD在N263位點的N -糖基化修飾是其促進CRC生長和肝轉移的關鍵因素，缺失該修飾（N263Q突變）會導致腫瘤增殖能力下降、皮下腫瘤生長速度顯著減慢、轉移潛能喪失。

圖3 CTSD N263位點糖基化修飾位點驗證對CRC生長和轉移的影響

4.CTSD N-糖基化修飾對其細胞定位、穩定性及功能活性的影響

GeneCards顯示CTSD主要分布于細胞外基質、溶酶體和內體。免疫熒光實驗發現野生型（WT）CTSD與溶酶體標記物LAMP1、早期內體標記物EEA1、晚期內體標記物Rab7共定位，表明其正常運輸至溶酶體和內體；而突變體（N263Q、N134Q/N263Q）CTSD喪失與上述標記物的共定位能力，滯留于細胞質或錯誤定位。單突變體（N263Q）CTSD分泌量顯著低于WT細胞，提示N263糖基化缺失抑制其分泌；而雙突變體（N134Q/N263Q）CTSD 分泌量反而高于WT細胞，表明雙位點糖基化缺失可能解除某種分泌抑制機制。環己酰亞an（CHX）追蹤顯示WT CTSD在處理5小時后仍保持較高水平，半衰期較長，N263Q 突變體CTSD在處理3小時后顯著降解，半衰期縮短。使用CTSD特異性底物（GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2）和熒光法檢測發現，WT CTSD的酶活性顯著高于N263Q和N134Q/N263Q 突變體，雙突變體酶活性低，單突變體次之，表明糖基化位點數量與酶活性呈正相關。這表明N263糖基化是CTSD進入溶酶體/內體的必要條件，確保其在酸性環境中發揮功能，糖基化抑制蛋白降解，延長CTSD的半衰期，并直接影響CTSD的催化效率，促進其蛋白酶功能。此外，N263位點在定位和穩定性調控中起主導作用，而N134可能通過協同作用影響分泌和酶活。

圖4 CTSD第134和263位的N-糖基化調節其折疊位置、穩定性和功能活性

5. CTSD N-糖基化修飾的調控機制研究

隨后探究了 CTSD的N-糖基化修飾的調控機制，重點鑒定了參與其糖基化的轉移酶復合體及關鍵亞基。利用FLAG標簽富集CTSD野生型（WT）和N263Q突變體的互作蛋白，通過質譜分析差異結合蛋白，發現CTSD WT特異性結合235種蛋白，N263Q結合191種蛋白，其中45種蛋白僅與WT互作，其中DDOST是N -糖基轉移酶。N -糖基化起始于內質網中的寡糖轉移酶（OST）復合體，分為OST-A（催化亞基 STT3A）和OST-B（催化亞基STT3B），非催化亞基如DDOST可穩定復合體與底物的結合。隨后，通過CPTAC數據庫分析發現，STT3A、STT3B和DDOST在結腸癌組織中均顯著高表達，提示其與CRC進展相關。在SW480 細胞中敲除STT3B或DDOST后，CTSD分子量顯著降低，表明N- 糖基化修飾缺失；而敲除STT3A無明顯變化。免疫共沉淀驗證發現，CTSD WT與STT3B、DDOST顯著互作，而N263Q突變體與兩者的結合能力明顯減弱，CTSD與STT3A無明顯結合，表明STT3B是主要催化亞基。此外，免疫熒光共定位的結果表明CTSD與STT3B、DDOST在細胞質和內質網區域顯著共定位，而與STT3A無共定位。

圖5 CTSD N-糖基轉移酶鑒定

6. CTSD的N-糖基化修飾通過降解ACADM、調控鐵死亡促進CRC肝轉移的分子機制

通過比較CTSD野生型（WT）和N263Q突變型SW480 細胞的蛋白質組，篩選鑒定出391個差異表達蛋白（DEPs），其中WT中高表達的蛋白主要富集于蛋白酶活性、細胞遷移等通路，N263Q中高表達的蛋白涉及脂肪酸代謝、抗氧化反應等，通過CTSD WT特異性互作蛋白與DEPs的交集分析，初步篩選出8個候選分子：ACADM、PRDX3、ALDH2、EHHADH、DHCR7、TGFB1I1、IDH2、ALDH1A1。臨床相關性分析顯示，ACADM和PRDX3高表達患者的預后顯著優于低表達者，提示兩者可能為抑癌因子；TNM 分期分析發現ACADM表達隨CRC惡性程度（TNM分期）進展而降低，在肝轉移（IV 期）患者中表達低，表明 ACADM與轉移負相關，因此選為后續研究靶點。在CTSD WT和N263Q細胞中，CTSD表達水平相當，但N263Q細胞的ACADM蛋白水平顯著升高，提示CTSD糖基化促進 ACADM 降解。此外，Co-IP的結果表明CTSD WT與ACADM顯著結合，而N263Q突變體無法與 ACADM互作，表明CTSD的N263糖基化是其結合并降解ACADM的前提。最后，在90 例CRC組織中，CTSD 表達與ACADM 呈顯著負相關，且兩者在細胞質中共定位，進一步驗證 CTSD 對 ACADM 的降解作用在臨床樣本中普遍存在。

圖6 CTSD N263-糖基化修飾影響CTSD蛋白酶對ACADM的蛋白水解作用

研究結論：

本研究聚焦結直腸癌肝轉移中N-糖基化修飾機制，CTSD的N263位點糖基化在肝轉移灶中顯著上調，該修飾由STT3B和DDOST糖基轉移酶復合體調控。CTSD糖基化通過維持其溶酶體定位、穩定性及蛋白酶活性，促進降解ACADM蛋白，進而調控鐵死亡相關蛋白（ACSL4、SLC7A11、GPX4），增強CRC細胞侵襲轉移能力。體內實驗顯示，敲除N263 糖基化可抑制裸鼠腫瘤生長及肝轉移。該研究揭示CTSD-N263 糖基化通過“STT3B/DDOST-ACADM-鐵死亡軸" 驅動轉移，為CRC治療提供了新靶點與理論依據。

研究思維導圖：

參考文獻：

Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39716927; PMCID: PMC11831497.