ZNF683? NK細胞通過重塑免疫微環境調控晚期下咽鱗狀細胞癌的化療敏感性

一、研究背景

下咽鱗狀細胞癌（HPSCC） 作為頭頸癌中預后最差的亞型之一，因解剖位置隱匿，多數患者確診時已處于晚期，其5年生存率僅為25%-35%。目前，TPF方案（多西ta賽+順bo+5-氟尿mi啶） 是其標準一線誘導化療，但臨床上約有10-20%的患者存在先天性耐藥，不僅無效還延誤了其他治療時機，然而其耐藥的根本免疫學機制尚不清楚。其次，盡管此前研究利用基因組學初步探索了頭頸癌耐藥特征，但常規轉錄組測序（Bulk RNA-seq）只能反映細胞群體的平均表達水平，無法區分腫瘤細胞與微環境中復雜的免疫細胞亞群，更缺乏專門針對HPSCC這一特定亞型、且涵蓋化療前后配對樣本的縱向單細胞尺度分析。因此，亟需通過高分辨率的單細胞轉錄組技術，系統繪制化療過程中腫瘤免疫微環境的動態演變圖譜，以期發掘能夠預測化療應答的有效生物標志物，并闡明先天耐藥的免疫逃逸機制，從而為篩選受益人群及設計克服耐藥的聯合免疫治療策略提供理論依據。

二、關鍵技術總結

單細胞轉錄組測序與免疫圖譜構建

研究采用10x Genomics單細胞免疫組庫技術，對下咽鱗狀細胞癌（HPSCC）患者接受TPF化療前后的腫瘤樣本進行縱向單細胞RNA測序，在單細胞分辨率下描繪了化療驅動的免疫微環境動態圖譜。通過UMAP降維、偽時間軌跡分析和差異基因表達分析，研究從157,019個CD45+免疫細胞中識別出9個主要亞群，并發現基線ZNF683+ NK細胞在化療敏感者中顯著富集，其浸潤比例與腫瘤退縮率呈正相關（R=0.616）。該技術突破了傳統bulk測序無法區分細胞異質性的局限，揭示了NK細胞而非其他免疫亞群是決定TPF療效的關鍵免疫組分，為后續機制研究提供了精準的細胞靶向基礎。

多重免疫組化與空間定位驗證

研究運用酪胺信號放大技術的多重熒光免疫組化，在組織切片上同時標記CD56、ZNF683、CD8、GZMK、PD-1及pan-cytokeratin等多種標志物，實現了對目標免疫細胞的空間可視化與半定量分析。該方法確認ZNF683+ NK細胞主要分布于腫瘤間質區，且在化療敏感組中密度顯著高于非敏感組。同時，通過表面標志物CX3CR1和KIT的篩選，研究確立了CX3CR1?KIT?表型作為ZNF683+ NK細胞的替代分選策略，解決了ZNF683作為核轉錄因子無法通過流式直接檢測的難題。該技術橋接了單細胞轉錄組數據與組織原位信息，為生物標志物的臨床轉化提供了可靠的空間證據。

體外共培養與體內基因敲除的功能驗證

研究建立了兩大功能驗證體系。體外實驗中，將分選的ZNF683+ NK細胞（CX3CR1?KIT?）與自體CD8+ T細胞共培養，發現直接接觸可顯著促進PD-1^mid GZMK+ CD8+ T細胞擴增，而Transwell隔離或MHC-I抗體阻斷則消除該效應，證實其依賴MHC-I/CD8介導的物理接觸。體內研究中，團隊構建了ZNF683條件性敲除小鼠（Znf683^(flox/flox) Ncr^(Cre)），特異性敲除NK細胞中的ZNF683后，NK細胞MHC-I表達顯著下降，且失去刺激CD8+ T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力。此外，小鼠腫瘤模型顯示NK細胞耗竭可wan全消除TPF化療的抗腫瘤效果，從功能學上確立了ZNF683+ NK-GZMK+ CD8+ T軸作為化療敏感性的核心執行通路。

三、主要研究成果

1、研究設計與實驗框架

圖1、研究設計與實驗框架

研究分為發現隊列（Discovery cohort）和驗證隊列（Validation cohort）。發現隊列納入2020年1月至2022年12月期間接受兩個周期TPF化療的12例HPSCC患者，在化療前后分別采集配對原發腫瘤樣本，用于單細胞RNA測序和RNA-seq分析。驗證隊列納入2023年1月至2025年4月期間的41例患者，提供配對或非配對腫瘤樣本，用于多重免疫組化（mIHC）和流式細胞術（FACS）驗證。根據實體瘤療效評價標準（RECIST 1.1指南），通過增強MRI測量化療前及第二周期化療后4周的腫瘤直徑變化，計算腫瘤退縮率（TSR）。患者分為四組：wan全緩解（CR，靶病灶全部消失）、部分緩解（PR，靶病灶直徑總和減少≥30%）、疾病進展（PD，靶病灶直徑總和增加≥20%）和疾病穩定（SD，介于PR與PD之間）。后續免疫浸潤分析中，將CR和PR患者合并為應答者（Rs，7例），將PD和SD患者合并為非應答者（NRs，5例）。兩組患者在年齡、飲酒史、吸煙史、臨床分期、病理分級及原發灶部位等臨床變量上無顯著差異。隨后，通過FACS分選活CD45+免疫細胞進行10x Genomics單細胞免疫組庫測序，獲取157,019個細胞的轉錄組數據；同時結合bulk RNA-seq進行PCA和GSVA分析；利用mIHC實現組織原位空間驗證；并通過體外共培養實驗和小鼠MEER腫瘤模型（含NK細胞清除和ZNF683條件性敲除）進行功能機制驗證。

2、HPSCC免疫浸潤景觀

單細胞測序結果共呈現了157,019個CD45+免疫細胞的單細胞轉錄組UMAP降維可視化，共鑒定出9個主要免疫細胞亞群，包括髓系來源細胞（巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞）和淋巴系細胞（T細胞、B細胞、漿細胞、NK細胞）。通過典型標志物基因表達熱圖驗證了各亞群的身份注釋。UMAP投影顯示細胞未按患者來源、化療前后或治療應答狀態產生批次效應，保證了數據整合的可靠性。然而，各患者間免疫組成存在顯著異質性，提示需要深入挖掘與化療敏感性相關的關鍵免疫亞群。這為后續識別NK細胞作為化療敏感性決定因素奠定了單細胞水平的全景式免疫圖譜基礎。

圖2、HPSCC免疫浸潤景觀

3、NK細胞浸潤決定TPF化療療效

研究發現，HPSCC腫瘤組織中免疫細胞浸潤率為71.86±23.96%，共鑒定出9個免疫亞群。比較分析顯示，化療前應答者（Rs）的NK細胞浸潤比例顯著高于非應答者（NRs），而其余8種免疫亞群在兩組間均無差異。基線NK細胞頻率與腫瘤退縮率呈正相關（R=0.616），但化療后兩組免疫譜無差異，提示基線NK細胞是TPF化療敏感性的潛在預測指標。流式細胞術（CD45?CD3?CD56?）和mIHC在獨立驗證隊列中進一步確認，應答者呈現彌漫性間質主導的NK細胞浸潤模式，而非應答者則表現為稀疏分布，從蛋白層面驗證了單細胞測序的發現。為明確NK細胞的功能必要性，研究建立C57BL/6小鼠MEER同源腫瘤模型，分為對照組、NK清除組（抗NK1.1）、TPF單藥組及TPF聯合抗NK1.1組。結果顯示，抗NK1.1有效清除NK細胞且不影響小鼠體重。TPF化療顯著抑制腫瘤生長，但聯合NK清除后TPF的抗腫瘤效果幾乎wan全消失，腫瘤體積和重量均顯著增加。該體內功能實驗直接證明，NK細胞活性是TPF化療發揮療效不ke或缺的決定因素，而非僅僅作為相關性標志物。

圖3、NK細胞浸潤決定治療應答

4、NK細胞亞型預測化療應答

為深入解析NK細胞的異質性，研究對7,539個NK細胞進行單細胞轉錄組分析，基于經典標志基因鑒定出三個功能各異的亞群：NK1（ZNF683?）、NK2（CX3CR1?）和NK3（KIT?）。所有亞群均表達NK特征基因（如GNLY、NKG7），RNA速度分析提示NK1向NK2存在潛在發育軌跡。定量分析顯示，NK1細胞在應答者中顯著富集，而NK2和NK3亞群在應答者與非應答者間無差異；其他免疫細胞亞群（CD4?/CD8? T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞）同樣未見組間差異。PCA分析顯示應答者與非應答者化療前的轉錄組存在顯著分離。進一步基于差異表達基因構建特征評分，確認NK1亞群評分在應答者中顯著升高。TCGA數據庫分析表明，NK/NK1特征評分與HNSCC患者較好預后顯著相關，而NK2/NK3評分無此關聯。以上結果共同確立了基線ZNF683? NK1細胞浸潤作為TPF化療敏感性預測因子的核心地位，且這種預測能力具有NK1亞群特異性。

圖4、NK細胞亞型預測化療應答

5、ZNF683? NK細胞的臨床價值

為將單細胞發現轉化為臨床可應用的檢測方案，研究通過mIHC對HPSCC組織中ZNF683? NK細胞進行空間定位和定量分析。結果顯示，ZNF683? NK細胞主要分布于腫瘤間質區，偶見于瘤巢內，在化療敏感組中呈現更高的細胞密度和熒光強度。定量分析確認應答者中ZNF683? NK細胞密度顯著高于非應答者（p<0.001），且差異主要來源于間質區域而非瘤巢內部，建立了其預測TPF敏感性的臨床價值。鑒于ZNF683為核轉錄因子無法通過流式細胞術直接檢測，研究者通過mIHC表面標志物篩選發現ZNF683? NK細胞不表達CX3CR1或KIT（CD117），提示CX3CR1（NK2）和KIT（NK3）可作為亞型特異性表面標志物。流式細胞術成功將HPSCC NK細胞分為CX3CR1?、KIT?及CX3CR1?KIT?雙陰性三群，后續RNA和蛋白定量證實ZNF683僅富集于CX3CR1?KIT?細胞中，由此定義了該表型為ZNF683? NK富集細胞。臨床分析顯示，CX3CR1?KIT?細胞在應答者中顯著富集，而CX3CR1?或KIT?亞群無組間差異，成功建立了基于表面標志物的ZNF683? NK細胞臨床檢測策略，為前瞻性患者篩選提供了可行工具。

圖5、ZNF683? NK細胞的臨床價值

6、ZNF683+ NK細胞促進T細胞免疫應答

為解析ZNF683? NK細胞的功能特征，研究首先對三種NK亞型進行GO和KEGG通路富集分析。結果顯示，ZNF683? NK細胞（NK1）特異性富集于T細胞活化與招募相關通路（如“α-β T細胞活化調控"、“淋巴細胞活化參與免疫應答"、“T細胞趨化"及“細胞因子-細胞因子受體互作"），而NK2（CX3CR1?）富集于細胞毒性通路（如“細胞殺傷"、“NK細胞介導的細胞毒性"），NK3（KIT?）則富集于前體樣增殖分化通路。UMAP通路活性評分進一步驗證了各亞型的功能專一性，表明ZNF683? NK細胞主要通過調控T細胞而非直接殺傷腫瘤來發揮作用。

為明確ZNF683? NK細胞調控的具體T細胞靶群，研究將T細胞進一步分為15個亞群（7個CD4?、8個CD8?），并聚焦于TCR克隆擴增分析（鑒于東南亞HPV相關HPSCC低流行）。結果顯示，化療后應答者中高度擴增T細胞克隆（擴增倍數≥4）的比例顯著高于非應答者；縱向比較表明，僅在應答者中，化療后高度擴增克隆比例較化療前顯著上升，非應答者中無此變化。該結果揭示了ZNF683? NK細胞通過招募和促進T細胞克隆擴增參與抗腫瘤免疫應答，為理解其在化療敏感性中的非經典功能提供了機制線索。

7、GZMK?CD8? T細胞介導TPF化療應答

圖7、GZMK?CD8? T細胞介導TPF化療應答

為明確介導化療敏感性的具體T細胞效應群體，研究對CD8? T細胞亞群進行深入分析，檢測了干細胞性（SLAMF6/TCF7）、細胞毒性（GZMB/IFNG/TNF）和耗竭（HAVCR2/LAG3/PDCD1）標志物的表達。結果顯示，GZMK?CD8?效應記憶T細胞（T_EM） 獨特地共表達細胞毒性分子TNF和IFN-γ（雙陽性頻率顯著高于GZMK?細胞），同時低表達耗竭標志物，且表達干細胞樣標志物SLAMF6和TCF7，呈現多功能抗腫瘤效應表型兼具干性維持能力的雙峰組成。進一步流式分析確認，PD-1?GZMK?CD8? T細胞為CCR7?CD45RA?的T_EM表型，且PD-1中等表達細胞GZMK水平高于PD-1高表達亞群。mIHC追蹤顯示，化療后應答者中PD-1?GZMK?CD8? T細胞（黃色）顯著增加，主要位于間質區域，而非應答者中無此變化。小鼠腫瘤模型證實，TPF治療顯著提升PD-1^mid CD8? T細胞中TNF?IFN?細胞比例（主要由CD62L?CD69?效應記憶表型構成），該效應在聯合抗NK1.1清除NK細胞后被wan全消除，而PD-1^low或PD-1^high CD8?亞群無變化。以上結果確立了GZMK?CD8? T_EM細胞為TPF化療應答的核心T細胞效應群體，且其擴增嚴格依賴于NK細胞的參與。

8、ZNF683? NK與CD8? T細胞通過MHC-I介導的crosstalk

為闡明ZNF683? NK細胞驅動GZMK?CD8? T細胞分化的分子機制，研究者開展了一系列體外和體內功能實驗。首先，從HPSCC組織中分選ZNF683? NK（CX3CR1?/KIT?）和ZNF683? NK（CX3CR1?KIT?）細胞，與自體外周血CD8? T細胞在接觸式和Transwell條件下共培養。結果顯示，直接接觸共培養顯著增加PD-1^mid GZMK?CD8? T細胞的增殖，而Transwell隔離wan全消除此效應，證實兩者間的對話為接觸依賴性。生物信息學CellChat分析預測ZNF683? NK與GZMK?CD8? T細胞間存在強相互作用信號，其中MHC-I介導的通路（HLA-A/B/C-CD8A/B結合）占主導地位。進一步使用MHC-I抗體（抗HLA-ABC）阻斷后，PD-1^mid GZMK?CD8? T細胞的擴增被wan全消除。為在體內驗證ZNF683的關鍵作用，研究者構建了ZNF683條件性敲除小鼠（Znf683^(flox/flox) Ncr^(Cre)），在NK細胞中特異性敲除ZNF683。結果顯示，ZNF683缺陷的NK細胞MHC-I表達顯著降低，且與CD8? T細胞共培養時促進CD8? T細胞活化（PD-1表達升高）及分泌IFN-γ和TNF-α的能力明顯減弱。綜上，該部分確立了ZNF683? NK細胞通過MHC-I/CD8依賴的物理接觸驅動多功能GZMK?CD8?效應T細胞分化的完整機制通路，揭示了ZNF683作為轉錄因子調控NK細胞MHC-I表達進而影響T細胞功能的關鍵分子軸。

圖8、ZNF683+ NK與CD8+ T細胞通過MHC-I介導的crosstalk

四、研究的意義及不足

該研究通過縱向單細胞轉錄組測序、空間多重免疫組化及體內外功能驗證，在下咽鱗狀細胞癌中揭示了ZNF683? NK細胞作為TPF化療敏感性的核心地位， NK細胞的存在與否直接決定了T細胞抗腫瘤應答能否被有效啟動，并闡明了其通過MHC-I/CD8依賴的物理接觸驅動GZMK?CD8?效應記憶T細胞分化的免疫機制，打破了以細胞毒性為核心的NK細胞功能認知范式。研究建立了CX3CR1?KIT?作為ZNF683? NK細胞的替代表面標志物檢測方案，為臨床前瞻性篩選化療敏感患者提供了可行工具，同時提出NK-T細胞免疫軸可作為克服化療耐藥的潛在治療靶點，具有明確的轉化醫學價值。

然而，研究也存在一些不足之處 首先，體外共培養實驗中因活檢腫瘤組織CD8? T細胞數量不足，研究者使用同一患者外周血CD8? T細胞替代，未能wan全模擬腫瘤微環境中T細胞的狀態。其次，ZNF683? NK細胞如何特異性招募GZMK? T細胞共定位的趨化機制尚不明確，是否存在中間細胞類型介導仍需探索。第三，非應答者中NK細胞浸潤減少的機制尚不明確，可能涉及TGF-β等免疫抑制因子、癌相關成纖維細胞（CAF）構成的物理屏障或趨化因子配體表達不足等，但本研究未對此進行深入解析，有待后續探究。此外，樣本量相對有限，部分應答者中NK細胞評分較低且與部分緩解組接近臨界值，提示預測閾值需在大規模前瞻性隊列中進一步驗證。最后，NK細胞與T細胞之間超微結構特殊化（如突觸膜延伸）如何增強MHC-I介導的信號傳導效率，仍需更高分辨率的成像研究加以闡明。