“陷阱“與“叛變“：NETs如何策反巨噬細胞共建肝癌轉移微環境

一、研究背景

肝細胞癌（HCC）是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，常在慢性肝臟炎癥（如乙/丙型肝炎病毒感染、酒精濫用或非酒精性脂肪性肝炎）背景下發生發展。腫瘤微環境（TME）中富集著多種免疫細胞，其中中性粒細胞和巨噬細胞是調控腫瘤促進性炎癥和免疫逃逸的關鍵角色。

中性粒細胞胞外陷阱（NETs）是由活化中性粒細胞釋放的網狀結構，由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成。除最初發現的捕獲病原體的功能外，NETs還可通過促進轉移、調節免疫反應和血管生成等方式參與癌癥進展。已有研究表明，NETs攜帶多種損傷相關分子模式（DAMPs），可差異性地調控腫瘤細胞和免疫細胞功能。

腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）具有顯著可塑性，可分化為促炎型M1和促腫瘤型M2巨噬細胞。M2巨噬細胞又可進一步細分為M2a、M2b、M2c和M2d亞群，其中M2d亞群因高分泌IL-10、TGF-β和VEGF而備受關注，在腫瘤進展、血管生成和免疫抑制中發揮重要作用。然而，中性粒細胞與巨噬細胞在HCC微環境中的相互作用及其對疾病進展的貢獻機制仍不清楚。本研究旨在闡明NETs介導的巨噬細胞重編程機制及其對腫瘤進展的影響，并探索中性粒細胞與巨噬細胞之間是否存在相互調控的反饋環路

我來詳細閱讀并解讀這篇關于中性粒細胞-巨噬細胞串擾通過NETs-IL-17/VEGF/S100A9軸促進肝細胞癌進展的研究論文。

二、研究結果

2.1 NETs水平在HCC患者中升高，尤其在晚期和轉移階段

基于TCGA-LIHC隊列（368例腫瘤樣本和50例癌旁正常樣本）的生物信息學分析顯示，36個NETs相關基因中大多數在HCC組織中顯著上調。在臨床樣本驗證中，HCC患者肝組織中的CD66b?中性粒細胞浸潤和CitH3（瓜氨酸化組蛋白H3，NETs特異性標志物）表達均顯著高于健康對照（HC）。HCC患者外周血中性粒細胞中CitH3表達也明顯升高。血清MPO-DNA（循環NETs標志物）水平在HCC患者中顯著升高，且與TNM分期呈正相關，IV期患者最高。值得注意的是，伴轉移的HCC患者MPO-DNA水平更高，尤其是伴肝外轉移者。外周血中性粒細胞中CitH3在肝外轉移患者中也顯著升高。這些結果表明NETs水平與HCC進展和轉移密切相關。

2.2 HCC中M2巨噬細胞富集與NETs形成密切相關

TCGA數據分析顯示，M2相關基因在HCC組織中普遍上調，而M1相關基因表達模式不一致。免疫熒光染色證實HCC腫瘤中CD68?CD206?M2巨噬細胞顯著增加。血清中M2d相關細胞因子TGF-β、VEGF、IL-10和CCL13在HCC患者中顯著升高。進一步的相關性分析揭示NETs相關基因與M2巨噬細胞標志基因呈正相關。HCC組織中NETs水平高的區域伴隨更多M2巨噬細胞浸潤，且血清M2d細胞因子水平與MPO-DNA呈正相關。這些臨床數據提示中性粒細胞與M2巨噬細胞在HCC腫瘤微環境中存在潛在相互作用。

2.3 NETs在HCC細胞存在時促進M2d巨噬細胞極化

體外實驗首先證實NETs單獨刺激不能直接誘導THP-1來源或PBMC來源的M0巨噬細胞向M1（CD68?CD86?）或M2（CD68?CD206?）極化。為模擬腫瘤微環境，建立了多細胞共培養體系：將M0巨噬細胞與正常肝細胞（THLE-2）或HCC細胞（HuH-7）共培養，同時加入或不加入NETs。結果顯示，與HuH-7細胞單獨共培養可適度增加M2巨噬細胞比例；加入NETs后，M2極化顯著增強且呈時間依賴性。而與THLE-2共培養時NETs無此效應。M2d相關基因（VEGF、IL-10、TGF-β）的mRNA水平及蛋白分泌在NETs+HuH-7組顯著上調，M1標志物iNOS和TNF-α則無顯著變化。這些結果表明NETs需要在HCC細胞存在的環境下才能有效促進M2d極化。

2.4 NETs攜帶的IL-17激活IL-17R/NF-κB信號通路介導M2巨噬細胞極化

為探究NETs調控巨噬細胞極化的機制，對三組THP-1-M0（單獨培養、與HuH-7共培養、與HuH-7+NETs共培養）進行轉錄組測序。KEGG分析顯示，與單獨培養組相比，共培養組共同富集了14條關鍵信號通路，其中IL-17和TNF信號通路在NETs添加組（C vs B）中尤為突出。引入IL-17R抑制劑AMG827后，NETs誘導的M2極化顯著受抑，VEGF和IL-10表達下降。

進一步鑒定IL-17來源發現：HCC患者來源的NETs中IL-17蛋白水平顯著高于健康對照，ELISA定量也證實NETs攜帶的IL-17在HCC患者中顯著升高。HCC患者中性粒細胞胞內IL-17水平也顯著增高。免疫熒光顯示IL-17廣泛沉積在HCC患者NETs上。由于NF-κB是IL-17R激活的關鍵下游效應分子，實驗證實NETs增加巨噬細胞中NF-κB p-p65水平，而AMG827可減弱此效應。NF-κB抑制劑BAY11-7082同樣可抑制NETs誘導的M2極化和M2d細胞因子分泌。綜上，NETs通過攜帶的IL-17激活IL-17R/NF-κB信號通路促進M2d極化。

2.5 NETs誘導的M2d巨噬細胞極化加劇HCC惡性進展

為評估NETs介導的M2d對HCC惡性行為的影響，制備了四種條件培養基（CM）：CM(HuH-7/HepG2)、CM(HuH-7/HepG2+M0)、CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)和CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs+AMG827)。結果顯示，各組對HCC細胞增殖和凋亡無顯著影響。但CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)顯著增強HUVEC管腔形成能力（血管生成），AMG 827可部分逆轉此效應。

體內皮下移植瘤實驗中，將Hepa1-6細胞與RAW264.7和NETs共注射可顯著增加腫瘤體積和重量，PCNA（增殖標志物）、CD31和VEGF（血管生成標志物）、CD206（M2標志物）及CitH3表達均上調，而CD86（M1標志物）無變化。AMG 827可部分逆轉這些效應。在DEN/CCl4誘導的自發性HCC模型中，LPS誘導NETs形成可顯著促進HCC進展（增加腫瘤負荷、肝/體重比和腫瘤面積），DNase I（降解NETs）或AMG827均可部分逆轉。免疫組化/免疫熒光證實NETs誘導增加M2（F4/80?CD206?）積累及Ki67、CD31、VEGF上調。這些體內外結果驗證了IL-17信號在NETs誘導M2極化和促腫瘤功能中的關鍵作用。

2.6 NETs誘導M2d巨噬細胞極化促進HCC轉移

Transwell遷移和侵襲實驗顯示，CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)顯著增加HuH-7和HepG2細胞的遷移和侵襲能力，AMG 827處理可部分減少。機制研究發現，該條件培養基降低上皮標志物E-cadherin、增加間充質標志物N-cadherin表達，提示EMT過程被激活；同時侵襲相關蛋白MMP2和MMP9表達升高，AMG827可逆轉這些分子改變。

體內肺轉移模型中，尾靜脈注射Hepa1-6+RAW264.7+NETs組小鼠肺組織重量、轉移結節數和轉移面積均顯著增加，AMG827可部分抑制。這些結果一致表明NETs介導的M2d極化可促進HCC轉移。

2.7 M2d巨噬細胞來源的VEGF通過間接促進HCC細胞來源的S100A9誘導NETs形成

為探究NETs誘導的M2d是否反過來調控NETs釋放，將中性粒細胞暴露于不同條件培養基。CM-M0對CitH3無顯著影響；CM-HuH-7可誘導CitH3上調；CM-(HuH-7+M0)進一步增強；CM-(HuH-7+M0+NETs)達到高水平。免疫熒光檢測DNA/MPO/CitH3也證實相同趨勢，表明HCC細胞來源因子促進NET形成，而與NETs誘導的M2d串擾具有更強的刺激效應。

鑒于前期研究發現HCC細胞釋放的S100A9促進NET形成，本研究檢測發現CM-(HuH-7+M0+NETs)顯著上調HuH-7細胞S100A9表達，ELISA定量也證實培養上清中S100A9升高。加入S100A9抑制劑Paquinimod后，CM-(HuH-7+M0)和CM-(HuH-7+M0+NETs)誘導的CitH3均顯著下調，免疫熒光也證實NETs形成減少。進一步探索M2d調控S100A9的機制：由于NF-κB驅動S100A9表達，且M2d分泌大量VEGF可激活NF-κB，假設M2d通過VEGF-NF-κB軸誘導S100A9。VEGFR抑制劑AV-951處理顯著降低HuH-7細胞中p-p65(S536)和S100A9水平。外源性VEGF刺激增加S100A9和p-p65，而NF-κB抑制劑BAY11-7082可消除這些效應。臨床樣本相關性分析顯示：NETs-IL-17與MPO-DNA正相關；VEGF與NETs-IL-17正相關；S100A9與VEGF正相關；S100A9與MPO-DNA正相關。這些相關性數據支持NETs-IL-17→VEGF→S100A9→NETs的正反饋環路存在。

2.8 中性粒細胞來源的NETs-IL-17在HCC患者中的臨床意義

按臨床病理參數分層分析NETs-IL-17分布：性別、年齡、腫瘤大小和數量對NETs-IL-17水平無顯著影響，提示該標志物不受這些基線變量影響。TNM I+II期與III+IV期間無顯著差異（p=0.06），有無轉移間也無差異。但在伴轉移的病例中，肝外轉移者NETs-IL-17顯著高于無肝外轉移者（p=0.0001）。

ROC曲線分析顯示：區分早晚期HCC時，NETs、NETs-IL-17、VEGF和S100A9的AUC分別為0.61、0.65、0.51和0.54，判別能力有限。預測總體轉移狀態時AUC分別為0.64、0.57、0.51和0.53，表現同樣一般。但預測肝外轉移時，NETs和NETs-IL-17的AUC分別提升至0.80和0.89，顯著優于VEGF（0.61）和S100A9（0.62）。在所有檢測標志物中，NETs-IL-17對肝外轉移的識別能力強，顯示出作為預測HCC肝外轉移的非侵入性生物標志物的潛力。

三、研究結論

本研究揭示了HCC腫瘤微環境中中性粒細胞與巨噬細胞之間通過NETs-IL-17/VEGF/S100A9軸建立的正反饋環路，具體機制如下：

? NETs→M2d極化：HCC微環境中，中性粒細胞釋放的NETs攜帶IL-17，通過激活巨噬細胞表面IL-17R及其下游NF-κB信號通路，誘導巨噬細胞向促腫瘤的M2d表型極化。此過程需要HCC細胞的存在，NETs單獨不能直接誘導極化。

? M2d→NETs形成：極化的M2d巨噬細胞分泌VEGF，通過VEGFR激活HCC細胞中NF-κB信號，上調S100A9表達。S100A9作為DAMP進一步刺激中性粒細胞釋放更多NETs，完成正反饋循環。

? 促腫瘤效應：該正反饋環路加速HCC生長（促進血管生成）、侵襲和轉移（誘導EMT、上調MMP2/9）。

? 臨床轉化價值：NETs-IL-17在預測HCC肝外轉移方面具有優異的診斷效能（AUC=0.89），優于傳統標志物，可作為無創生物標志物用于高風險患者的早期識別。同時，該軸的多個節點（NETs形成、IL-17R、VEGF、S100A9）均為可藥物干預的靶點，為HCC的聯合治療策略提供了新思路。