SCI ADV 丨1區(qū)TOP：FSP1和組蛋白去乙酰化酶抑制癌癥持久細(xì)胞鐵死亡

《FSP1和組蛋白去乙酰化酶抑制癌癥持久細(xì)胞鐵死亡》系統(tǒng)性揭示癌癥持久細(xì)胞（persister cells）對(duì)鐵死亡敏感性的關(guān)鍵機(jī)制，并提出了新的潛在治療策略。成果發(fā)表在Science Advances雜志（IF：12.5）；

《Science Advances》是美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（AAAS）在2015年創(chuàng)辦的綜合性、開(kāi)放獲取期刊，旨在快速傳播高質(zhì)量的跨學(xué)科研究；于2015年創(chuàng)刊，發(fā)表具有重要?jiǎng)?chuàng)新意義的研究，傳承《Science》的高標(biāo)準(zhǔn)，廣泛，包括生命科學(xué)、物理學(xué)、材料科學(xué)、工程學(xué)、環(huán)境科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)及社會(huì)科學(xué)等；周刊，年文章數(shù)量2000篇左右；版面費(fèi)：USD 4950。

研究背景：

持久細(xì)胞是指在靶向治療中存活下來(lái)的腫瘤細(xì)胞，它們能耐受治療、引發(fā)微小殘留病灶、積累突變，并可能導(dǎo)致耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。此前研究發(fā)現(xiàn)，持久細(xì)胞對(duì)鐵死亡（一種鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞死亡）敏感，特別是通過(guò)抑制GPX4可誘導(dǎo)其死亡。但GPX4抑制劑在臨床應(yīng)用中面臨毒性大、生物利用度低、體內(nèi)效果差等問(wèn)題。目前尚不清楚為什么持久細(xì)胞對(duì)鐵死亡高度敏感，尤其是在其鐵代謝、谷胱gan肽水平、抗氧化酶表達(dá)等方面存在顯著異質(zhì)性的情況下。本研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序和功能驗(yàn)證，揭示了癌癥持久細(xì)胞的線粒體活性氧依賴(lài)和FSP1下調(diào)是其鐵死亡敏感的關(guān)鍵內(nèi)在機(jī)制；并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，利用臨床可得的組蛋白去乙酰化酶抑制劑可增加其氧化應(yīng)激，從而與GPX4抑制產(chǎn)生協(xié)同作用，為選擇性清除持久細(xì)胞提供了新的聯(lián)合治療策略。

研究方法：

使用EGFR突變的PC9肺癌細(xì)胞、BRAF突變的A375黑色素瘤細(xì)胞、HER2擴(kuò)增的BT474乳腺癌細(xì)胞的持久細(xì)胞模型。通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析持久細(xì)胞在GPX4抑制劑RSL3處理后的轉(zhuǎn)錄變化。使用Seahorse分析氧耗率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體ROS（mitoSOX）和總ROS（CellROX）。Western blot檢測(cè)NRF2、KEAP1、FSP1、GPX4等蛋白；GSH/GSSG檢測(cè)谷胱gan肽水平。測(cè)試FSP1抑制劑（iFSP1）、組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi，如panobinostat、vorinostat）與GPX4抑制劑的協(xié)同作用。

主要研究結(jié)果：

1. 線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）及其產(chǎn)生的活性氧（ROS）是癌癥持久細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感的關(guān)鍵機(jī)制

研究首先通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，能在GPX4抑制劑（RSL3）處理后存活的持久細(xì)胞，其氧化磷酸化（OXPHOS）相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，暗示高OXPHOS可能導(dǎo)致鐵死亡易感性。隨后的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與親代細(xì)胞相比，持久細(xì)胞確實(shí)具有更高的OXPHOS活性和隨之產(chǎn)生的線粒體活性氧（ROS）水平。最關(guān)鍵的直接證據(jù)是，使用線粒體靶向抗氧化劑MitoTEMPO清除ROS后，能有效保護(hù)持久細(xì)胞免于鐵死亡，而對(duì)親代細(xì)胞影響甚微。這些結(jié)果共同構(gòu)成了一個(gè)完整的邏輯鏈條：持久細(xì)胞依賴(lài)高OXPHOS代謝，這導(dǎo)致其線粒體ROS本底水平升高，從而使其脂質(zhì)膜系統(tǒng)對(duì)GPX4抑制引發(fā)的過(guò)氧化攻擊更為脆弱，最終決定了其對(duì)鐵死亡的獨(dú)特敏感性。

圖1 氧化磷酸化促進(jìn)癌癥持久細(xì)胞的鐵死亡增敏

2. 持久細(xì)胞存在多樣化的抗氧化缺陷，并依賴(lài)FSP1以在GPX4抑制下存活

研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同模型中的持久細(xì)胞在NRF2抗氧化通路活性、胱an酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC7A11）表達(dá)及谷胱gan肽水平上存在差異，但FSP1蛋白的表達(dá)卻在不同類(lèi)型的持久細(xì)胞中普遍下調(diào)。然而，在經(jīng)受GPX4抑制劑（RSL3）攻擊后幸存的持久細(xì)胞中，FSP1的mRNA表達(dá)反而出現(xiàn)上調(diào)，表明這些細(xì)胞轉(zhuǎn)而依賴(lài)殘余的FSP1作為生存的儲(chǔ)備。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推斷：?jiǎn)为?dú)抑制FSP1對(duì)細(xì)胞活力影響甚微，但當(dāng)其與亞致死劑量的GPX4抑制劑聯(lián)用時(shí)，能產(chǎn)生強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)，選擇性且顯著地殺傷持久細(xì)胞，而對(duì)親代細(xì)胞的殺傷效果則弱得多。這些結(jié)果表明，FSP1的下調(diào)是持久細(xì)胞的內(nèi)在脆弱性之一，而抑制FSP1可阻斷其在GPX4失活后的關(guān)鍵逃逸通路，從而為通過(guò)“雙靶點(diǎn)抑制"策略選擇性清除持久細(xì)胞提供了有力的理論依據(jù)。研究結(jié)果揭示了癌癥持久細(xì)胞在抗氧化防御系統(tǒng)上存在異質(zhì)性缺陷，并明確了FSP1是其存活的關(guān)鍵代償機(jī)制和治療靶點(diǎn)。

圖2 持久細(xì)胞存在多樣化的抗氧化缺陷，并依賴(lài)FSP1以在GPX4抑制下存活

3. HDAC抑制與GPX4抑制協(xié)同作用，以選擇性殺傷持久細(xì)胞

臨床上已批準(zhǔn)的組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，能夠選擇性地與GPX4抑制劑協(xié)同，高效清除癌癥持久細(xì)胞。 研究通過(guò)系統(tǒng)的藥物聯(lián)用分析（Bliss協(xié)同模型）證明，無(wú)論是帕比司他還是伏立諾他，與GPX4抑制劑（RSL3）聯(lián)合使用時(shí)，在肺癌（PC9）、黑色素瘤（A375）和乳腺癌（BT474）的持久細(xì)胞模型中均顯示出強(qiáng)烈的協(xié)同殺傷效應(yīng)（圖中呈現(xiàn)紅色區(qū)域與正協(xié)同分?jǐn)?shù)），而對(duì)照的親代細(xì)胞則無(wú)此效應(yīng)甚至出現(xiàn)拮抗（綠色區(qū)域）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，這種協(xié)同作用具有高度選擇性，僅需使用無(wú)細(xì)胞毒性的低劑量HDAC抑制劑對(duì)持久細(xì)胞進(jìn)行短期預(yù)處理，便能使其對(duì)后續(xù)GPX4抑制劑的敏感性顯著增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)共同表明，通過(guò)HDAC抑制劑調(diào)控持久細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)，可以打破其耐受平衡，使其對(duì)鐵死亡“致敏"。這為克服GPX4抑制劑單藥治療的局限性，開(kāi)發(fā)一種能選擇性gen除殘留疾病、防止復(fù)發(fā)的聯(lián)合療法提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖3 HDAC抑制與GPX4抑制協(xié)同作用，以選擇性殺傷持久細(xì)胞

4. HDAC抑制劑通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增敏持久細(xì)胞鐵死亡

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，盡管轉(zhuǎn)錄組分析顯示HDAC抑制劑（帕比司他）處理上調(diào)了持久細(xì)胞中與谷胱gan肽代謝和血紅素代謝相關(guān)的基因集，但直接測(cè)量表明，藥物處理并未降低細(xì)胞內(nèi)的谷胱gan肽水平，反而降低了不穩(wěn)定鐵池的含量，排除了這兩種常見(jiàn)途徑的貢獻(xiàn)。關(guān)鍵的機(jī)制證據(jù)在于，帕比司他處理顯著提升了持久細(xì)胞的總活性氧和線粒體活性氧水平。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ROS的核心作用：使用線粒體靶向抗氧化劑（MitoTEMPO）或廣譜抗氧化劑，能夠wan全阻斷HDAC抑制劑所帶來(lái)的鐵死亡增敏效應(yīng)，使其無(wú)法與GPX4抑制劑產(chǎn)生協(xié)同殺傷。這些結(jié)果共同表明，HDAC抑制劑選擇性地將持久細(xì)胞推向一個(gè)氧化還原態(tài)失衡的“臨界狀態(tài)"，使其固有的線粒體ROS本底升高，從而極大地降低了觸發(fā)鐵死亡的閾值。這為前述觀察到的選擇性協(xié)同效應(yīng)提供了直接的機(jī)制解釋?zhuān)⒋_立了“誘導(dǎo)氧化應(yīng)激"作為清除持久細(xì)胞的一種有效策略。

圖4 HDAC抑制劑通過(guò)誘導(dǎo)持久細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而增敏其對(duì)鐵死亡的響應(yīng)

5. 圖示總結(jié)

概念模型圖總結(jié)了全文的核心邏輯：左半部分 (FSP1機(jī)制)：GPX4抑制劑（GPX4i）迫使持久細(xì)胞依賴(lài)FSP1存活；聯(lián)合使用FSP1抑制劑（FSP1i）可阻斷此退路，導(dǎo)致鐵死亡。

右半部分 (HDAC抑制劑機(jī)制)：HDAC抑制劑處理通過(guò)增加氧化應(yīng)激，使持久細(xì)胞對(duì)GPX4抑制劑誘導(dǎo)的鐵死亡更加敏感。

本研究不僅揭示了持久細(xì)胞鐵死亡敏感的內(nèi)在機(jī)制（線粒體ROS依賴(lài)和FSP1代償），更發(fā)現(xiàn)了兩種可轉(zhuǎn)化的治療策略（靶向FSP1或使用HDAC抑制劑），為清除癌癥持久細(xì)胞、防止復(fù)發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和方案。

圖5 研究模式圖。癌癥持久細(xì)胞能夠通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，從而在GPX4抑制（GPX4i）下存活。然而，耐受GPX4i的持久細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)而依賴(lài)另一鐵死亡抑制酶FSP1來(lái)維持生存，此時(shí)聯(lián)合使用FSP1抑制劑（FSP1i）可顯著增加其鐵死亡。此外，使用臨床上可得的HDAC抑制劑進(jìn)行無(wú)毒劑量的預(yù)處理或共處理，能夠提升持久細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而與GPX4抑制劑（GPX4i）產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)持久細(xì)胞鐵死亡。

研究結(jié)果的局限性：

1、模型局限性：僅使用少數(shù)細(xì)胞系和藥物誘導(dǎo)的持久細(xì)胞模型，結(jié)論是否適用于更多腫瘤類(lèi)型和體內(nèi)環(huán)境仍需驗(yàn)證。

2、機(jī)制未wan全闡明：HDAC抑制劑如何精確調(diào)控線粒體ROS的分子機(jī)制尚未明確。

3、體內(nèi)數(shù)據(jù)缺乏：研究主要在體外進(jìn)行，缺乏動(dòng)物模型驗(yàn)證聯(lián)合治療的療效與安全性。

4、未涉及其他鐵死亡調(diào)控因子：如膜修復(fù)機(jī)制、脂質(zhì)代謝等可能影響鐵死亡的因素未深入探討